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一种玉米整株TRV载体介冰球突破网站导病毒诱导基因沉默沉静要领

一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默沉静要领与流程


本发现属于植物基因工程技能规模,详细涉及一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默沉静要领。

配景先容

植物突变体很可贵到,有些基因的突变对植物大概是致死的,基因沉默沉静相对容易得到,病毒诱导的基因沉默沉静(Virus-induced gene silencing,VIGS)是一种转录后基因沉默沉静技能,作为一种有效的反向遗传学技能已经遍及应用于植物基因工程的研究中,其浸染道理是植物在抵制病毒侵染时会启动RNA沉默沉静(RNA silencing)机制。植物体内的Dicer-like protein4可以识别病毒复制进程中发生dsRNA,并将其切割成21-24nt的siRNAs(small interferingRNAs),siRNAs中的一条链与Agronatue(AGO)等卵白团结形成RNA诱导的沉默沉静复合体(RNA induced silencing complex,RISC),并特异的与同源的靶标mRNA团结最终导致靶标mRNA的降解,这一进程即病毒诱导的基因沉默沉静。同样的,假如将寄主植物基因的片断克隆岛病毒VIGS载体中,当寄主植物通过RNA沉默沉静引起防止回响时,相应的寄主基因也会被沉默沉静。

一系列改革过的RNA或DNA病毒载体被用于VIGS(Becker and Lange,2010)。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)是一类应用较量遍及并且效率和耐久性较好的病毒载体,可以或许介导基因沉默沉静同时不会带来病毒诱导的症状。改革后的病毒可以或许促进非病毒序列的插入以及对植物的后续传染,也可以判断宿主植物发展点的基因,因此TRV在植物基因成果判断中具有遍及的应用。

玉米(学名:Zea mays),亦称玉蜀黍、包谷、苞米、棒子。粤语称为粟米,闽南语称作番麦。是一年生禾本科草本植物,是重要的粮食作物和重要的饲料来历,也是全世界总产量最高的粮食作物。玉米也是我国重要的粮食作物,玉米基因组测序的劈头完成为玉米成果基因组学的研究提供了重要的参考(Schnable et al.,2009)。可是玉米基因组巨大,突变体不易得到,遗传转化坚苦,受基因型限制等这些对玉米基因成果的研究带来了诸多未便。



技能实现要素:

为了办理上述问题,本发现提供一种快速利便的玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默沉静要领及应用,可以或许快速高效的在整个玉米植株中沉默沉静目标基因。

一种玉米整株TRV载体介导病毒诱导基因沉默沉静的要领,详细步调如下:

步调(1):取玉米种子50粒,用刀片将胚上方的种皮划开;用有效氯为1%的次氯酸

钠消毒液举办种子消毒,备用;

步调(2):用基因工程的要领将扩增后的番茄八氢番茄红素脱氢酶(下称:番茄PDS)基因片断毗连到TRV病毒诱导基因沉默沉静载体pTRV2中,获得pTRV-SlPDS;

详细步调如下:

cDNA合成:按TaKaRa提取试剂盒操纵说明提取番茄的总RNA,以1μg的总RNA做模板,凭据TaKaRacDNA合成试剂盒操纵说明合成cDNA的第一链,然后稀释10倍备用;

PDS基因扩增:设计引物,上游引物5’-CGGGGTACCGGCACTCAACTTTATAAACC-3’和下游引物5’-CGGGGATCCTTCAGTTTTCTGTCAAACC-3’,以番茄的cDNA第一链为模板、用KAPA HiFi PCR Kits的50μL体系举办扩增;扩增措施为95℃预变性3min;30个轮回的98℃变性20s,60℃退火20s,72℃延伸30s;72℃后延伸5min,4℃生存;PCR产品经电泳检测为单一条带,纯化后备用;番茄的cDNA经PCR扩增后的产品为409-bp番茄PDS基因片断;

pTRV-SlPDS质粒构建:纯化后的PCR基因片断经KpnI-BamHI双酶切后,与经KpnI-BamHI双酶切的pTRV2质粒用T4-DNA毗连酶毗连,毗连产品转化到大肠杆菌DH5α感觉态细胞,涂布于含有50mg/L Kan抗生素的LB平板造就基,37℃倒置留宿造就,长出单克隆,挑取单克隆至含有50mg/LKan抗生素的液体LB造就基中,37℃,250转每分钟震荡造就12小时,提取质粒,验证正确后,备用;

步调(3)农杆菌转化及造就:

3.1)将验证正确的pTRV-SlPDS、pTRV2以及pTRV1质粒别离用液氮冻融法转化到农杆菌GV3101感觉态细胞中,所述的液氮冻融法详细要领为:取农杆菌GV3101感觉态细胞,冰上融化,插手200纳克待转质粒,冰浴30分钟,液氮速冻2分钟,37℃水浴锅水浴2分钟,冰浴2分钟,插手800微升无抗LB液体造就基,28℃180转每分钟震荡造就3小时,涂布于含有50mg/L Kna和50mg/L Rif抗生素的固体LB造就基上,28℃倒置避光造就3天长出单克隆;挑取单克隆于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif抗生素的液体LB造就基中,28℃200转每分钟震荡造就24小时,经菌液PCR判断及格后,获得含有质粒pTRV1、pTRV2和pTRV-SlPDS农杆菌GV3101阳性菌株,记为TRV1、TRV2和TRV-SlPDS,保菌备用;

3.2)将含有TRV1、TRV2、TRV-SlPDS质粒的农杆菌GV3101菌液,别离在含有抗生素的LB平板造就基上划线,28℃倒置避光造就3天长出单克隆;

3.3)别离挑取3.2)中的单克隆放于含有抗生素的LB液体造就基中,用离心管在28℃、200转/min条件下,震荡造就24小时,以实现单克隆的增殖;

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